在线引物设计 Primer3

常规 PCR · qPCR · 克隆 / 质粒构建 · 测序引物
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1. 模板序列 支持 FASTA 或纯序列，自动去除空格/数字，最长 10000 bp

常用扩增引物，产物 100–1000 bp
未输入

2. 引物参数 长度 / Tm / GC / 单碱基重复

目标区域：引物对必须覆盖该区间（例如 qPCR 跨外显子连接处）。
避开区域：引物与产物都不得落在该区间（例如需要避开的 SNP、重复序列）。
5' 端附加序列只拼接在引物 5' 端，不参与 Primer3 的 Tm 计算。
高级参数：PCR 体系盐浓度 / 引物浓度
计算由 Primer3 完成；Tm 另用 Biopython 最近邻模型交叉复核。
使用建议：
1. 常规 PCR 优先选 Penalty 最低、ΔTm < 2 °C、3' 端无严重二聚体/发夹结构的引物对。
2. qPCR 引物还需 BLAST 检查特异性，尽量跨外显子连接处设计，并用标准曲线验证扩增效率。
3. 克隆引物若添加酶切位点或同源臂，请确认附加序列不含内部酶切位点，且长度计入合成订单。
4. Primer3 只做热力学与序列质量评估，不判断基因组特异性；重要实验请结合 BLAST / Primer-BLAST 复核。