引物匹配检查 Primer / Template Check

结合位点 · 逐碱基比对 · 3' 端错配 · 二聚体/发夹 · 扩增子
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当前显示的是内置示例结果（通过 ?demo=1 直接生成），用于确认功能和结果显示是否正常。

1. 模板与引物 输入模板 DNA 和已有的正向/反向引物（5'→3'）

未输入
只需检查一条引物时，另一条可以留空。若引物 5' 端带酶切位点或同源臂， 系统会自动识别并只比对 3' 侧的核心序列。
盐浓度使用默认值：一价盐 50 mM、Mg²⁺ 1.5 mM、dNTP 0.6 mM、引物 50 nM。
直接查看示例结果 比对与热力学计算由 Primer3 完成，Tm 另用 Biopython 复核。

检查结果 模板 717 bp · 允许错配 ≤2

检查完成： 正向引物 1 个结合位点， 反向引物 1 个结合位点， 可形成 252 bp 扩增子。
文本比对结果（BLAST 风格）可直接复制 
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 Primer / Template Match Report
 引物 / 模板匹配报告
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Template length : 717 bp
Max mismatches  : 2

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Query 1: 正向引物 Forward
Sequence : TCAAGGAGGACGGCAACATC
Length   : 20 nt
GC       : 55.0%
Tm       : 60.0 °C (Primer3)
Sites    : 1 within 2 mismatches

> Site 1  (Plus strand)  392-411  |  Mismatches 0/20 (100.0%)  |  3' mismatches 0
Query     1 TCAAGGAGGACGGCAACATC 20
            ||||||||||||||||||||
Sbjct   392 TCAAGGAGGACGGCAACATC 411

----------------------------------------------------------------------
Query 2: 反向引物 Reverse
Sequence : TCTCGTTGGGGTCTTTGCTC
Length   : 20 nt
GC       : 55.0%
Tm       : 60.0 °C (Primer3)
Sites    : 1 within 2 mismatches

> Site 1  (Minus strand)  624-643  |  Mismatches 0/20 (100.0%)  |  3' mismatches 0
Query     1 TCTCGTTGGGGTCTTTGCTC 20
            ||||||||||||||||||||
Sbjct   643 TCTCGTTGGGGTCTTTGCTC 624

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Amplicon / 扩增子
Product size : 252 bp
Position     : 392-643 (plus strand)
GC           : 59.1%
Total mismatches : 0
3' mismatches: F=0  R=0
Amplicon combinations found: 1

Warnings / 提示
  ! 两条引物与模板完全匹配，且能形成预期扩增子。
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提示与风险
  • 两条引物与模板完全匹配，且能形成预期扩增子。
两条引物与模板完全匹配，可形成 252 bp 的扩增子。

正向引物 Forward

TCAAGGAGGACGGCAACATC
Tm (Primer3)
60.0 °C
GC 含量
55.0%
结合位点数
1
发夹 Tm
无
同源二聚体 Tm
-24.5 °C
异源二聚体 Tm
3.7 °C
最强结合位点：正链 392–411 · 匹配度 100.0% · 错配 0 · 3' 端 5 nt 错配 0

反向引物 Reverse

TCTCGTTGGGGTCTTTGCTC
Tm (Primer3)
60.0 °C
GC 含量
55.0%
结合位点数
1
发夹 Tm
无
同源二聚体 Tm
-33.8 °C
异源二聚体 Tm
3.7 °C
最强结合位点：负链 624–643 · 匹配度 100.0% · 错配 0 · 3' 端 5 nt 错配 0

扩增子组合 按 3' 端错配 → 总错配 → 预期长度排序

#产物长度 (bp)GC% 正向位点F 错配F 3'错配 反向位点R 错配R 3'错配总错配
1 252 59.1 392–411 0 0 624–643 0 0 0
正向引物结合区 反向引物结合区 坐标为模板正链 1-based。
扩增子序列（252 bp，GC 59.1%）

正向引物结合位点 显示错配 ≤2 的位点，按错配数排序

位点 1 正链 392–411 匹配度 100.0% 错配 0 3' 端 5 nt 错配 0
引物 5'TCAAGGAGGACGGCAACATC3' |||||||||||||||||||| 模板 5'TCAAGGAGGACGGCAACATC3'

反向引物结合位点 引物以反向互补形式匹配正链，3' 端位于结合区左端

位点 1 负链（正链坐标 624–643） 匹配度 100.0% 错配 0 3' 端 5 nt 错配 0
引物 5'TCTCGTTGGGGTCTTTGCTC3' |||||||||||||||||||| 负链 5'TCTCGTTGGGGTCTTTGCTC3'
说明：本工具只针对你提供的这条模板做匹配检查，不能替代基因组/转录组范围的 BLAST 特异性验证。
3' 末端（尤其最后 2–3 nt）的错配会显著降低延伸效率；5' 端错配通常影响较小。
发夹/二聚体 Tm 高于 45 °C 时已在结果中标红，建议调整引物或提高退火温度后重新评估。
check-v3 · 2026-10-29